Механізм дії діазепаму зумовлений стимуляцією бензодіазепінових рецепторів супрамолекулярного ГАМК-бензодіазепін-хлоріонофор рецепторного комплексу, що приводить до посилення інгібуючої дії ГАМК (медіатор пре- і пост-синаптичного гальмування в усіх відділах ЦНС) на передачу нервових імпульсів.
Препарат має седативну, снодійну, протитривожну, протисудомну, міорелаксантну та амнестичну дію. Посилює дію снодійних, наркотичних, нейролептичних, аналгетичних препаратів, алкоголю. Прийом діазепаму тривалий час може призвести до залежності від препарату.
Чинить виражену анксіолітичну і протисудомну дію; дещо слабкіше виражений снодійний і центральний міорелаксуючий ефект. Механізм дії діазепаму тісно пов’язаний із гальмівним ендогенним нейромедіатором гамма-аміномасляною кислотою (ГАМК).
Діазепам діє у Danio rerio у вищому діапазоні доз (1-10 мг/л), ніж феназепам (0,1-1 мг/л). Водночас для діазепаму характерний куполоподібний дозозалежний ефект на відміну від дії феназепаму .